利用密度感應抑制技術控制水產養殖細菌性病害的基礎研究

利用密度感應抑制技術控制水產養殖細菌性病害的基礎研究

作者:師大云端圖書館 時間:2015-08-26 分類:碩士論文 喜歡:2955
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【摘要】水產養殖業是全球食物生產增長最快的系統之一,但是病害頻發阻礙了其進一步健康地發展。目前,抗生素是公認的治療細菌性疾病的有效方法。抗生素的濫用使藥物殘留問題嚴重,并進一步加快了細菌抗藥性的出現。密度感應(quorumsensing,QS)是微生物之間的一種交流機制,用于調控基因的表達以及協調微生物的群體性行為,如生物被膜的形成、生物發光和毒力因子的分泌等。研究發現在多種致病菌中,致病因子的分泌和QS密切相關。抗生素的濫用使得細菌抗藥性問題越來越嚴重。由于QS不是微生物生存所必需的,因此淬滅致病菌的密度感應系統(quorumquenching,QQ)可以在不殺死細菌的情況下大大地降低其毒力因子的表達,同時降低環境中的選擇壓力和出現細菌抗藥性的幾率,因此密度感應淬滅技術是一種極具開發前景的細菌性病害的控制手段。相關研究表明海洋中蘊含著豐富的QQ酶資源,而目前發現的QQ活性物質特別是QQ酶主要來源于陸地微生物。本論文建立了一種高通量的QQ菌株篩選方法,從牙鲆體內及養殖環境中分離篩選土著QQ菌株,對具有強QQ活性的耐油具柄菌(Muricaudaolearia)Th120的QQ活性物質進行了鑒定,并完成了該菌株的全基因組測序及分析。本論文研究結果可為發展以密度感應淬滅技術為基礎的、健康可持續發展的水產養殖細菌性疾病的預防和控制手段提供理論基礎。為了能從數量龐大的海洋微生物中快速鑒定QQ細菌,本論文建立了一種簡單快速的QQ菌株高通量篩選方法。該方法采用的AHL報告菌根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)對AHL分子具有高靈敏度的檢測能力,為達到高通量篩選的目的,在檢測方法上主要有兩個關鍵步驟:一方面通過標準化檢測吸光度值,消除報告菌細胞的影響,從而大大提高了檢測的準確度并實現β-半乳糖苷酶活性的定量檢測;另一方面通過使用緩沖液PIPES,有效地排除了因pH值過高而導致的假陽性QQ菌株。該方法能同時對大批量的待測菌株進行高效地篩選。利用該方法從分離自健康牙鲆腸道、鰓、粘液以及養殖環境的366株土著菌中篩選到了25株QQ細菌。這些QQ細菌分別屬于黃桿菌綱、α變形菌綱以及γ變形菌綱的14個種,其中12個種的細菌其AHL降解活性為首次報道。進一步研究發現,這些QQ細菌的AHL降解特性各不相同,部分菌株的AHL降解活性被證明是內酯酶活性。具強QQ活性的海黏奧雷氏菌(Olleyamarilimosa)T168、居珊瑚假交替單胞菌(Pseudoalteromonasprydzensis)Th125以及耐油具柄菌(M.olearia)Th120能夠提高斑馬魚抗嗜水氣單胞菌侵染的能力,表明其具有進一步開發為水產養殖有益菌的潛力。對強QQ活性菌株耐油具柄菌Th120的進一步研究發現,該菌株可能同時具有QQ酶和QS小分子阻抑物。利用膠內QQ活性檢測、蛋白質譜檢測以及全基因組測序技術發現菌株Th120的5個蛋白具AHL降解活性。包括一個AHL內酯酶及一個AHL酰基轉移酶,分別將其命名為MomL(Muricaudaoleariamarinelactonase)和MomA(M.oleariamarineacylase)。在已鑒定的AHL內酯酶中,MomL與AiiA的氨基酸序列相似度最高(一致性為28.85%)。MomL具有信號肽序列,是目前金屬-β-內酰胺酶家族中唯一一個分泌到胞外的AHL內酯酶。MomL具有高效的AHL降解活性,對C6-HSL的降解效率是AiiA的10倍左右,能降解不同碳鏈長度(C4-C14)的AHL分子,對長鏈以及3號碳位帶羰基的AHL分子具有更高的降解效率。MomL的最適反應溫度為40°C,經60°C處理30min后,保留32%的活性。MomL是一種金屬蛋白,對Mg2+的親和性高,但是不易結合Co2+,推測Be2+可促進其AHL降解活性,而AiiA的結合金屬主要是Zn2+。定點突變研究發現氨基酸殘基位點His117,His119,Asp121,His122,His189和His214對其AHL降解活性是必需的。BLAST檢索發現MomL的同源蛋白主要分布于海洋黃桿菌科細菌中,因此MomL的分泌特性、AHL降解機制以及活性位點等結果均表明其代表一類新型海洋AHL內酯酶。重組MomL能夠有效抑制銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)胞外蛋白酶的分泌以及綠膿菌素的產生,表明其具有進一步開發應用的潛力。采用Illumina高通量測序技術對Th120的全基因組進行了測序及分析,經RAST服務器分析后共得到17條contigs和11條scaffolds序列,測得的基因組大小為3.94Mbp,G+C含量為43.86%。共預測到3730個基因。通過COG,KEGG等數據庫對菌株Th120基因組的注釋分析發現,相比于其他代表性的海洋黃桿菌科細菌,菌株Th120中參與糖類轉運與代謝、轉錄、信號轉導、無機離子的轉運和代謝以及防御機制等生物過程的基因比例較高。其中鐵元素代謝相關的基因尤其豐富,Th120含有22個鐵運輸相關的基因,其中5個為鐵載體受體蛋白編碼基因。菌株Th120中主要由SufABCDSE組成的SUF系統來合成Fe-S簇,而MomL的編碼基因處于suf操縱子之內;由于MomL的活性受Fe2+的抑制作用,因此推測MomL可能參與調控Fe-S簇的合成。此外,通過本地BLAST檢索預測到一個N-酰基氨基酸水解酶,可能具有降解N-酰基高絲氨酸(MomL降解AHL的產物)的活性。本論文篩選到的QQ細菌中,海黏奧雷氏菌T168、鰨魚附著桿菌(Tenacibaculumsoleae)T133和異色附著桿菌(T.discolor)T84都屬于黃桿菌科細菌,其中菌株T168和T133的AHL降解活性被證明為內酯酶活性,但是這三種細菌的QQ酶編碼基因還未得到鑒定。以AHL降解酶MomL和MomA的氨基酸序列為基礎,結合NCBI數據庫中的附著桿菌屬以及奧雷氏菌屬的細菌的全基因組序列,預測發現海黏奧雷氏菌、鰨魚附著桿菌和異色附著桿菌可能都具有MomL的同源蛋白,而鰨魚附著桿菌和異色附著桿菌同時具有MomA的同源蛋白。綜上所述,本論文建立了一種QQ菌株的高通量篩選方法,用這種方法篩選到25株共14個種的QQ細菌,其中12種細菌的QQ活性為首次報道。耐油具柄菌Th120有5個蛋白具有AHL降解活性。QQ酶MomL代表一類新型海洋AHL內酯酶,其同源蛋白可能普遍存在于海洋黃桿菌科細菌中。對Th120的全基因組分析發現其鐵元素代謝相關基因比例較高,而MomL可能參與調控Fe-S簇的合成。本論文研究結果可為發展健康可持續發展的水產養殖細菌性疾病的預防和控制手段提供理論基礎。
【作者】湯開浩;
【導師】張曉華;
【作者基本信息】中國海洋大學,微生物學,2014,博士
【關鍵詞】密度感應抑制技術;細菌性病害;耐油具柄菌;密度感應淬滅酶;

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