華南地區艱難梭菌流行病學研究與新型分子生物學檢測技術評估

華南地區艱難梭菌流行病學研究與新型分子生物學檢測技術評估

作者:師大云端圖書館 時間:2015-11-24 分類:參考文獻 喜歡:1332
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【摘要】艱難梭菌(Clostridiumdifficile,C.difficile)是一種嚴格厭氧生長的革蘭陽性梭狀芽孢桿菌,為人類腸道中的正常菌群。艱難梭菌感染(Clostridiumdifficileinfection,CDI)是指艱難梭菌產毒菌株所致的感染,具備相應臨床癥狀(通常是腹瀉),并且實驗室檢測到艱難梭菌毒素或者分離出產毒菌株(糞便培養產毒艱難梭菌陽性,細胞培養細胞毒試驗陽性,結腸鏡檢或組織病理學檢查顯示假膜性腸炎)即可診斷。1978以來,人們逐漸認識到艱難梭菌與抗生素相關性腹瀉(Antibacterial-associateddiarrhea,AAD)有關,目前認為25%的AAD由艱難梭菌引發。CDI可導致患者住院時間延長,基礎疾病嚴重性和死亡率增加及醫療負擔加重。發病機制艱難梭菌主要在人與人之間通過糞口途徑傳播并定植于腸道。正常腸道菌群可有效抑制定植艱難梭菌的繁殖;抗生素等因素破壞腸道菌群平衡后可導致該菌過度生長,釋放毒素A和毒素B作用于腸道屏障。毒素A為腸毒素,通過改變細胞內的肌動蛋白直接作用于結腸細胞,引起炎癥反應。毒素B是細胞毒素,可導致細胞內染色質濃縮,誘使腸細胞凋亡。此外,艱難梭菌與索氏梭菌有交叉抗原,可被毒素中和,直接損傷腸壁細胞,造成偽膜性腸炎。臨床表現大部分患者感染艱難梭菌后無臨床癥狀,有臨床癥狀者可表現為輕至重度水樣腹瀉、爆發性腸炎甚至中毒性巨結腸、腸梗阻及偽膜性腸炎(Pseudomembranouscolitis,PMC)。約半數患者腹瀉出現于應用抗生素過程中或停用抗生素后短期內,偶有停藥數月后發病者。重癥患者可出現消耗性腹瀉(次數可達20~30次厭),同時伴有發熱、惡心、厭食、腹脹、腹痛等全身或局部癥狀。此外,有系統性疾病的患者常發生CDI。輔助檢查CDI患者CT掃描可表現為結腸壁增厚。腹部X線檢查可見麻痹性腸梗阻及“拇指紋”癥。內鏡及活檢可見結腸特征性改變,即散在黃色或白色橢圓形斑塊,邊界清楚,與黏膜粘連牢固,沖洗不易脫落。斑塊中央出現點狀灰白色或棕褐色偽膜,繼而融合并隆起成數毫米至1厘米大小斑塊,周圍常繞以紅暈。病灶間黏膜常無明顯炎癥,重者可融合成片狀甚至成管型。實驗室檢查可發現白蛋白水平下降,白細胞、血尿素氮、肌酐、血清轉鐵蛋白水平升高,糞便菌群失調及糞便白細胞等。診斷及治療根據廣譜抗生素應用史、嚴重腹瀉或便血以及結腸鏡下特征性表現(水腫、充血、偽膜和非特異性小潰瘍或糜爛),可作出CDI臨床診斷,確診有賴于細菌培養和毒素檢測結果。CDI實驗室診斷多基于腹瀉糞便中檢測其毒素A或者B。研究發現艱難梭菌產毒菌株大部分同時產生A毒素及B毒素,也有少部分產毒菌株僅僅產生B毒素。因此,實驗室及臨床常常通過檢測B毒素來確診CDI。目前實驗室檢測手段多種多樣,細胞培養細胞毒試驗(Cellculturecytotoxicityassayandtoxigenicculture)是檢測艱難梭菌產毒菌株的標準方法,但是標準檢測方法耗時費力,并且需要專業的研究人員。因此,一些微生物實驗室使用酶聯免疫分析法,谷氨酸脫氫酶(Glutamatedehydrogenase,GDH)抗原測試,以及PCR技術等快速檢測糞便中艱難梭菌。甲硝唑為目前治療CDI的首選藥物,口服治療7-14天(200-250mg,4次/天)。其次為萬古霉素(0.125g,4次厭),經甲硝唑治療無效或病情嚴重危及生命者服用該藥7-14天。對于腸梗阻嚴重患者,藥物可通過胃管、肛管注入結腸,必要時可考慮腸切除。其他治療藥物有桿菌肽(25500U,4次/天)、替考拉寧(200mg,1次厭)、夫西地酸(500mg,1次厭)、考來烯胺(4g,3-4次/天)。國外非達霉素治療CDI已經進入臨床應用,且實踐表明非達霉素經濟實惠,對萬古霉素治療失敗的CDI也有很好的治療效果,是目前治療CDI最有效的藥物。艱難梭菌相關性腹瀉(Clostridiumdifficileassociateddiarrhea,CDAD)多在治愈后7-14天復發,尚無針對復發的標準治療方案。糞便艱難梭菌毒素陽性患者增加10-14天療程的甲硝唑或萬古霉素(125mg,給藥間隔時間逐漸延長),可降低復發率。多次復發者應考慮在上述治療基礎上加用其他療法,如甲硝唑與萬古霉素聯合治療、考來烯胺聯合萬古霉素綜合治療、益生菌生物治療和靜脈滴注人免疫球蛋白等。近年來,對反復發作的難治性CDI,糞便移植法是研究熱點。從健康的供者(經嚴格的傳染性病原體篩查)選擇糞便,通過灌腸,鼻飼以及內鏡植入等方式,種植到CDI反復發作患者結腸中,以恢復患者腸道菌群穩態。大量臨床研究表明該法對反復發作性及難治性CDI具有很好的治療效果,是目前認為最有前途的治療方法。流行病學變化CDAD相關研究一直是熱點。過去20年,艱難梭菌的流行病學發生了很大變化。隨著廣譜抗菌藥物的廣泛使用,在全球范圍內,CDAD發病率不斷提高。美國密歇根的一項研究表明,2002年到20086年,CDI發生率增加了一倍。近些年艱難梭菌來出現暴發流行,患者病死率及感染復發率升高,引起醫學界的極大重視。CDI發生率增加及暴發流行的原因可能與高毒力菌株BI/NAP1/027(限制性內切酶分型BI,脈沖場凝膠電泳分型NAP1,PCR-核糖體分型027)有關,該027菌株毒素調節基因tcdC變異,產生二元毒素(Binarytoxin)以及較傳統產毒菌株15-20倍的毒素A和B。該菌株對非達霉素反應率低,并且具有高復發率、喹諾酮類耐藥,死亡率高(高達7%)等特點。自北美首發以來,歐美時常出現BI/NAP1/027暴發流行。澳大利亞以及亞洲的日本、韓國、新加坡及中國香港等地也有該菌株的報道。此外,過去認為是低危險因素的群體,如圍產期婦女和兒童等,以及社區獲得性艱難梭菌的感染率也呈增加趨勢。研究背景CDI在在歐美廣泛報道并監測、研究。亞洲對艱難梭菌的研究相對較少,主要集中于一些發達國家或地區,如日本、韓國、臺灣等地。中國大陸各級醫療機構中,艱難梭菌并不是一個需申報的感染。此外,限于技術及重視程度等原因,目前只有北京上海等部分大城市的醫院或者研究機構有檢測及研究。總的來說,艱難梭菌在中國流行情況目前尚不清楚,基礎研究也較為薄弱。研究目的和意義據我們近些年的臨床及科研經驗表明,國內CDI可能呈增加趨勢。究其原因,可能與近些年中國抗生素廣泛使用及老齡化社會來臨有關,也可能與受關注程度的增加以及內鏡等檢測技術的普及有關。鑒于此,從上世紀90年代起,我們機構對CDAD做了大量的研究工作。本次研究目的主要在:①了解南方醫院艱難梭菌的流行情況,分析國內CDI致病的危險因素并探尋能反映CDI病情變化的替代標志物(Surrogatemarker),為合理使用抗生素,預防CDI,提高診療效率并控制CDI流行提供參考。②分離鑒定艱難梭菌臨床菌株,并對其進行毒素分類(Toxinotyping)及核糖分型(Ribotyping),建立艱難梭菌菌種庫,為進一步研究艱難梭菌生物學特性、致病性和致病機制、研制有效疫苗打下基礎。③探索艱難梭菌快速有效的分子生物學檢測技術,以期快速便捷準確的用于臨床篩查,檢測并鑒定艱難梭菌,達到提高CDI診療效率,減緩細菌耐藥,控制院內感染播散,減輕醫療壓力的目的。研究內容研究對象:收集2009年12月-2013年12月南方醫院住院、門診以及部分社區患者共4456份腹瀉糞便(布里斯托分類5-7級)標本進行艱難梭菌分析。排除技術因素等原因丟棄的標本,4132份為適合CDI研究的糞便標本。技術方法:①收集2009年12月~2012年5月間南方醫院住院、門診及部分社區腹瀉患者新鮮糞便(排出體外半小時內)標本,提取糞便全基因組DNA,以傳統PCR技術檢測艱難梭菌B毒素基因tcdB。收集患者臨床數據進行分析,了解此期間南方醫院CDI的流行病學變化情況,并采用單因素及其基礎上的多因素logistic回歸分析患者CDI的獨立危險因素及探索能反映CDI病情變化的替代標志物。②4132份腹瀉糞便中一共有適合培養要求標本1962例。對其進行細胞毒測試(Cytotoxicityassay,CTA),并同時接種CCFA培養基厭氧培養,分離純化典型菌落,革蘭氏染色并1000倍油鏡觀察。再取典型菌落進行乳酸脫氫酶(Glutamatedehydrogenase,GDH)檢測及生化鑒定。提取成功鑒定為艱難梭菌的細菌DNA檢測艱難梭菌A、B毒素,二元毒素及核糖分型。最后,所有經鑒定的艱難梭菌菌株統一編號,-80℃保存,并收集患者臨床信息,建立南方醫院艱難梭菌菌種庫。③收集2012年7月至2012年12月之間南方醫院臨床成人(>18歲)腹瀉新鮮糞便標本140例(排除重復標本)。分別采用“金標準”——細胞培養細胞毒試驗進行檢測及CepheidGeneXpert(?)Dx(Cepheid,GX-XVI)系統檢測(該儀器可以特異性的檢測艱難梭菌tcdB基因,二元毒素cdt基因以及tcdC基因nt117位點缺失)。以McNemar及Kappa系數檢驗比較CepheidXpertC.difficile檢測糞便艱難梭菌與“金標準”檢測結果,了解兩種檢測技術的陽性率及一致性吻合情況,并采用MedCalc軟件評價XpertC.difficile檢測艱難梭菌的靈敏度,特異度等穩定性及可靠性指標,以及約登指數,陽性似然比及陰性似然比等儀器篩查指標,探討其臨床應用可能性及優勢。結果2009年12月到2012年5月之間南方醫院住院、門診及部分社區糞便標本共3855份,其中177例重復標本,18份因糞便量太少及不滿足新鮮糞便標本要求被排除,最后一共3660份標本納入研究。在這3660份新鮮標本(對應3660例患者)中,平均年齡為54.9±15.8歲,男性患者73.3%。其中住院患者為3324例(90.8%),重癥監護中心患者為24例(0.7%)。對3660份腹瀉標本進行艱難梭菌B毒素基因(tcdB)檢測,并進行感染危險因素及替代標志物分析。3660份腹瀉糞便標本艱難梭菌tcdB基因檢出率為15.6%,此期間南方醫院CDI率基本呈穩定趨勢。多因素logistic回歸分析結果顯示患者性別、年齡、是否有住院、Horn’sindex值、惡性腫瘤、炎性腸病、以及6周內灌腸、皮質醇類藥物、抗生素使用、胃腸插管及先前發生過CDI都是CDI的獨立危險因素。發熱、尿素氮、血肌酐、C-反映蛋白和白蛋白可作為判斷CDI的獨立標志物。在這些獨立危險因素及標志物中,以胃腸插管(P=0.000,OR=5.759),灌腸(P=0.000,OR=3.976),惡性腫瘤(P=0.013,OR=1.668),炎性腸病(P=0.019,OR=1.894),皮質醇類藥物(P=0.014,OR=2.223),抗生素(P=0.000,OR=1.851),先前發生過CDI(P=0.000,OR=4.107)發病風險最大,而白蛋白降低(P=0.000,OR=4.947)是有效的替代標志物。572例艱難梭菌陽性病人中,近3個月內有抗生素治療史為386列(67.5%),而3088例艱難梭菌陰性腹瀉標本中,有1624列(52.6%)患者3個月內有抗生素治療史。進一步對抗生素種類分類研究,結果表明CDI可能與以下幾種抗生素有關:二代頭孢(17.66%vs13.08%,P=0.000),三代頭孢(11.89%vs6.38%,P=0.000),氟喹諾酮(10.31%vs7.67%,P=0.03),克林霉素(6.29%vs4.27%,P=0.03)以及碳青霉烯類藥物(3.85%vs1.52%,P=0.000)。分離培養實驗中,1962例住院及門診患者平均年齡為56.46(±15.48),男性1120例(57.08%),女性842例(42.92%)。1962份新鮮糞便標本進行CCFA培養并分離鑒定,最終得到262份艱難梭菌臨床分離菌株,其中250例產毒菌株,產毒菌株陽性率為12.74%。入組患者以炎性腸病患者最多,有473例(24.11%),其中潰瘍性結腸炎患者198例(41.86%),克羅恩病患者275例(58.14%)。潰瘍性結腸炎及克羅恩病患者各有34例有CDI,感染率分別為17.17%及12.36%,UC和CD患者艱難梭菌的感染率差異不顯著紕=2.162,P=0.141)。男性炎性腸病患者共303例(占總數64.06%),女性炎性腸病患者共170例(35.94%),炎性腸病中男性和女性患者艱難梭菌的發病率無差異(χ2=0.023,P=0.878)。此外,IBD患者中,艱難梭菌陽性組平均年齡為38.35(±15.35),陰性組平均年齡為37.20(±14.84),兩組之間無統計學差別(t=-0.690,P=0.490),說明IBD患者中年齡對艱難梭菌發病率無影響。進一步進行A、B毒素檢測及二元毒素檢測:A+B+191(76.4%)份,A-B+59(23.6%)份。191份A+B+菌株中,10株二元毒素陽性,其中1株為高毒力型菌株BI/NAP1/027。最后,將分離得到的262株艱難梭菌統一編號,并收集患者姓名,ID,入院時間等人口學資料及臨床相關信息,連同毒素分類、核糖分型結果,利用計算機進行管理,建立起南方醫院艱難梭菌菌種庫。收集2012年7月至2012年12月之間南方醫院臨床成人(>18歲)腹瀉新鮮糞便標本140例,其中最常見的是克羅恩病34例(24.3%),依次為惡性腫瘤28例(20.0%),感染性疾病23例(16.4%),慢性疾病18例(12.9%),潰瘍性結腸炎15例(10.7%),術后6例(4.3%)以及自身免疫性疾病4例(2.9%)。140例糞便標本經標準SOP富集培養,細胞毒測試及中和實驗,最終得到48例產B毒素的艱難梭菌產毒菌株。經CepheidGeneXpert(?)Dx系統檢測得到46例B毒素陽性標本。CepheidXpertC.difficile檢測艱難梭菌陽性率和“金標準’役有區別,兩者之間的一致性好。該機器檢測艱難梭菌的靈敏度及特異度均大于90%,說明該機器發現感染的能力及正確識別不屬于感染的能力好,即漏診和誤診少。陽性似然比為42.17(CI:10.69-166.51),遠大于10,說明該儀器能正確診斷艱難梭菌的可能性非常大。約登指數為89.49%,說明該儀器篩查CDI的效果非常好,真實性高。該實驗進一步表明了我們實驗室建立的艱難梭菌培養法具有很好的可靠性及穩定性,適合作為長期研究的基礎培養方法。結論通過對艱難梭菌流行病學調查及危險因素分析,我們了解了南方醫院CDI人群的臨床特征,流行病學特點,感染相關危險因素及病情標志替代物。為及時監測CDI病情變化,合理使用抗生素,預防CDI,提高診療效率并控制醫院艱難梭菌流行,降低CDI的發病率及死亡率提供了依據。成功建立南方醫院艱難梭菌菌庫,為進一步研究艱難梭菌生物學特性、致病性和致病機制、分析CDI的流行特征,疫苗研究及其防治打下了基礎。并且首次在大陸分離出高致病性027型菌株(BI/NAP1/027),揭示了未來艱難梭菌在我國有暴發流行的可能,具有重要意義。我們實驗室采用的艱難梭菌培養法穩定可靠,對于艱難梭菌的長期研究極為有意義。此外,臨床試驗證實,與“金標準’細胞培養細胞毒試驗相比,CepheidXpertC.difficile檢測系統具有一致性好,方便快捷實惠可靠,相對清潔衛生,同時具有檢測二元毒素及027菌株的獨特優點,便于臨床篩查CDI及監測其暴發流行。對于預防CDI,指導臨床合理選擇用藥、提高CDI診療效率、減緩細菌耐藥,控制院內感染播散,減輕醫療壓力具有重要意義,可作為臨床艱難梭菌篩查的常規儀器。
【作者】王浦;
【導師】姜泊;陳燁;
【作者基本信息】南方醫科大學,內科學,2014,博士
【關鍵詞】艱難梭菌感染;抗生素相關性腹瀉;二元毒素;細胞毒試驗;炎癥性腸病;

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